mason/secretom/detail/functional_screens.mas

   1 <& /page/page_title.mas, title => 'Functional Screens to Identify Secreted Proteins' &>
   2
   3 <div class="page_introduction">
   4   <p>
   5   We have been developing and applying functional screens to identify
   6   genes encoding secreted proteins. The genes are identified based on
   7   the ultimate localization of the encoded protein, utilizing protein
   8   markers whose activities confirm targeting to the cell surface.
   9   </p>
  10 </div>
  11
  12 <&| /page/info_section.mas, title => 'Yeast Secretion Trap (YST) Screen' &>
  13
  14   <div style="width: 330px; margin: 0; margin-right: 2em; float: left" class="captioned_image caption_right">
  15
  16     <img src="/documents/img/secretom/YST_control_170.jpg" />
  17
  18     <p>
  19     Sucrose plate with no yeast colonies growing (negative control).
  20     </p>
  21
  22   </div>
  23
  24   <p>
  25   The YST screen can be used to test a specific cDNA of interest, or to
  26   screen a cDNA library.  The screen uses invertase, an enzyme that
  27   hydrolyzes sucrose to generate glucose and fructose, as a reporter
  28   gene/protein and yeast (<span class="species_binomial">S. cerevisiae</span>)
  29   as a host. If yeast cells are streaked onto plates containing sucrose
  30   as the sole carbon source, they must secrete invertase to break down
  31   the sucrose in order to grow, and so an invertase-deficient yeast
  32   mutant will be unable to grow.
  33   </p>
  34
  35
  36   <div style="width: 330px; margin: 0; margin-right: 2em; float: left" class="captioned_image caption_right">
  37
  38     <img src="/documents/img/secretom/YST_transformed_170.jpg" />
  39
  40     <p>
  41     Sucrose plate showing yeast colonies transformed with the YST vector library.
  42     </p>
  43
  44   </div>
  45
  46
  47   <p>
  48
  49   This system can also identify plasma membrane (PM)-spanning or
  50   PM-anchored proteins if the orientation of the fusion protein is such
  51   that the invertase component is external to the cell. The resulting
  52   yeast transformants can then be isolated and the plasmids containing
  53   the heterologous transgenes sequenced, allowing identification of the
  54   secreted protein. We typically also confirm the localization of
  55   candidates of interest by transient expression as GFP fusion proteins
  56   in onion epidermal cells, coupled with staining using the FM-64 dye to
  57   co-stain for the plasma membrane,
  58
  59   </p>
  60
  61 </&>
  62
  63 <&| /page/info_section.mas, title => 'Necrosis Inducing Protein (NIP) Secretion Trap Screen' &>
  64
  65   <div style="width: 350px; float: right; margin: 0 0 10px 20px;" class="captioned_image caption_left">
  66
  67     <img src="/documents/img/secretom/N_benth_NIP_x210.jpg" />
  68
  69     <p style="text-align: left">
  70     A <span class="species_binomial">Nicotiana benthamiana</span> leaf
  71     showing regions of HR indicating the presence of a secreted
  72     protein fused to NIP.
  73     </p>
  74
  75   </div>
  76
  77   <p>
  78   We have also developed a new technique termed the NIP secretion trap
  79   screen. Briefly, this involves ligating cDNAs in frame at the 5&rsquo;
  80   end of the DNA sequence encoding a gene termed necrosis-inducing
  81   protein (NIP) that has been truncated to remove the native secretory
  82   signal peptide. NIP was identified from the oomycete Phytophthora
  83   sojae, as a protein that induces a hypersensitive response (HR),
  84   resulting in cell death, in leaves of some plants when present in the
  85   apoplast. It does not cause HR when expressed in the plant
  86   cytosol. Constructs containing individual cDNA::Nip fusions are
  87   transformed into <span class="species_binomial">Agrobacterium
  88   tumefaciens</span>, which is then infiltrated into the apoplastic
  89   compartment of Nicotiana benthamiana leaves. Any proteins encoding SPs
  90   will be secreted from infected plant cells as NIP fusion proteins,
  91   causing a readily detectable HR.
  92   </p>
  93
  94   <p>
  95   The Nip fusion assay is a convenient and rapid means to confirm
  96   secretion of proteins in planta and complements the YST screen.
  97   </p>
  98
  99 </&>
 100
 101 <&| /page/info_section.mas, title => 'Objectives', is_subsection => 0 &>
 102
 103   <div style="width: 230px; margin: 0 0 10px 20px; float: right" class="captioned_image">
 104
 105     <img src="/documents/img/secretom/onion_cyto_secreted_200.jpg" />
 106
 107     <p style="text-align: left">
 108     A cytoplasmic protein (green) and a secreted protein (red) in
 109     plasmolyzed onion cells. Scale bar represents 50 microns.
 110     </p>
 111
 112   </div>
 113
 114   <ul>
 115     <li>
 116     Screen a range of tomato tissues for genes encoding secreted
 117     proteins, focusing particularly on fruit development and leaves at
 118     various stages of infections with <span class="species_binomial">
 119     Phytopthora infestans</span>.
 120     </li>
 121     <li>
 122     Annotate the corresponding genes and confirm their localization in
 123     the cell wall by transient expression as fluorescent fusion proteins
 124     in onion epidermal cells.
 125     </li>
 126     <li>
 127     Further examine the localization and trafficking pathways of
 128     candidates that show unexpected localization in the apoplast.
 129     </li>
 130   </ul>
 131
 132
 133
 134   <p>
 135   To date we have identified both known cell wall localized proteins as
 136   well as a number of proteins whose presence in the apoplast is
 137   unexpected, based on functional annotation, or the absence of a
 138   predicted secretory signal peptide, suggesting alternative
 139   non-canonical secretion pathways, as have describe in yeast and
 140   mammalian cells. We have also identified several proteins that show
 141   dual localization in the wall an intracellular compartments, and we
 142   are now characterizing some of the complexity in the secretory
 143   pathway.
 144   </p>
 145
 146 </&>
 147
 148 <&| /secretom/section_templates/data_items.mas &>
 149 - text: "Tomato (cv. Ailsa Craig) fruit (multiple growth and ripening stages): YST clones"
 150   ref: /download/data/secretom/Functional_screens/Tomato_fruit_YST_clones.xlsx
 151 - text: "Tomato (cv. Ailsa Craig) leaves infected with Phytophthora infestans: YST clones"
 152 </&>
 153
 154 <&| /secretom/section_templates/publications.mas &>
 155
 156 Yamane, H., Lee, S.-J., Kim, B.-D., Tao, R. and Rose, J.K.C. (2005) A coupled yeast signal sequence trap and transient plant expression strategy to identify and confirm genes encoding extracellular proteins from peach pistils. Journal of Experimental Botany 56: 2229-2238.
 157
 158 Lee, S.-J. Kelley, B., Damasceno, C.M.B., St. John, B., Kim, B.-S. Kim, B.-D. and Rose, J.K.C. (2006) A functional screen to characterize the secretomes of eukaryotic phytopathogens and their hosts in planta. Molecular Plant Microbe Interactions 12: 1368-1377.
 159
 160 Lee, S.-J., Kim, B.-D. and Rose, J.K.C. (2006) Identification of eukaryotic secreted and cell surface proteins using the yeast secretion trap screen.  Nature Protocols 1: 2439-2447.
 161
 162 Kelley, B.S., Lee, S.-J., Damasceno, C.M.B., Chakravarthy, S., Kim, B.-D., Martin, G.B. and Rose, J.K.C. (2010) A secreted effector protein (SNE1) from Phytophthora infestans is a broadly acting suppressor of programmed cell death. The Plant Journal 62: 357-366.
 163
 164 Lee, S.-J. and Rose, J.K.C. (2010) Mediation of the transition from biotrophy to necrotrophy in hemibiotrophic plant pathogens by secreted effector proteins. Plant Signaling and Behavior 5/6: 1559-2316.
 165
 166 Lee, S.-J. and Rose, J.K.C. (2010) Characterization of the plant cell wall proteome using high throughput screens (In press Methods in Molecular Biology).
 167
 168 </&>
 169